亚慢性全身毒性试验
1、定义
反复或持续接触试验样品后在动物寿命期的某一阶段发生的不良作用。啮齿动物亚慢毒性研究一般为90d，其他种属动物在不超过其寿命期的10%的阶段内。亚慢静脉研究一般规定接触时间为14d~28d。
2、试验依据
本试验依据GB/T 16886.11 或ISO 10993-11 附录H。
3、试验系统
一般采用啮齿动物（大鼠、小鼠）。如采用非啮齿动物应进行科学论证。
4、试验步骤
4.1 样品制备
每次试验前，按照GB/T 16886.12 制备样品极性浸提液和非极性浸提液。
4.2 动物试验
将24只动物随机分为浸提液组和对照组，每组雌雄各半。
从0天开始计，对大鼠进行连续14天的注射试验，每次注射前对大鼠进行称重并记录，对样品浸提液组动物尾静脉单次注射极性浸提液，对对照组动物尾静脉单次注射极性对照液，于1、4、7、10和13天同时进行腹腔单次注射非极性浸提液和非极性对照液，最后一次注射结束24h后安乐死解剖，见表1。
动物解剖前禁食12h，称取空腹体重。麻醉后，心脏取血，分别测定血液学、血液生化学各项指标；腹主动脉放血处死动物后，解剖观察各个组织器官是否出现异常，称取各脏器湿重值，计算各组织器官的脏器系数。将各脏器浸泡在10%福尔马林固定液固定72h后，进行常规组织病理学检查。
表1. 双途径给药建议的剂量参数
动物数量/性别/组别a | 途径 | 体积 mL/kgb | 给药频率 研究天数d | 注射速度 ml/min |
6 | 静脉 | 10 | 每天注射，连续14d | ≤2 |
腹腔 | 5c | 1,4,7,10,13 | 慢速 | |
a. 溶剂对照组动物（6只/性别）需要同样给药。 b. 建议的注射剂量体积。 c. 最好选棉籽油。 d. 给药天数从第0天开始。 | ||||
4.3 动物体重
在给予样品前即时测量动物体重，以及第一次接触后的每周(如试验周期需要)、试验终结时测量动物体重。
4.4 临床观察
观察频率和间隔时间宜根据毒性反应的性质和严重程度、反应速度和恢复周期来确定。在试验的早期阶段,可能需要增加观察次数。毒性症状出现和消失的时间、持续时间和动物死亡时间都是很重要的，特别是出现延迟性不良临床症状或死亡的迹象。为避免动物遭受不必要的痛苦，宜对动物实施国家或国际动物福利导则中规定的人道终点。接触试验样品后基本临床观察应考虑预期作用的高峰期。
应系统记录观察到的现象,并保留每只动物的观察记录。每天应至少一次采用实验室通用临床反应术语记录观察到的动物存活情况和明显的临床反应。长期重复接触研究每天应至少两次观察记录动物的发病率和死亡率。更长周期重复接触研究可考虑至少每周一次观察记录更大范围内的不良临床症状。
每日观察和记录供试品组和对照组动物的一般状态，如皮肤、被毛、眼和粘膜改变，以及呼吸、循环、自主和中枢神经系统和行为表现等状况。采用表2给出的描述语报告。
记录死亡的动物数并及时进行尸检，垂死动物及时隔离并处死。
典型的眼科检查采用检眼镜或其他同类适宜器具，宜在接触试验物质之前和试验期间进行检查。最好检查所有动物，至少检查高剂量组和对照组动物。如检出眼部改变，则宜对全部动物进行检查。异常检查宜形成文件并进行论证。
表2. 常见临床症状与观察项目
临床观察 | 观察症状 | 涉及的系统 |
呼吸 | 呼吸困难（腹式呼吸、气喘）、呼吸暂停、紫绀、呼吸急促、鼻流液 | 中枢神经系统（CNS）、肺、心脏 |
肌肉运动 | 嗜睡减轻或加重、扶正缺失、感觉缺乏、全身僵硬、共济失调、异常运动、俯卧、震颤、肌束抽搐 | CNS、躯体肌肉、感觉、神经肌肉、自主性 |
痉挛 | 阵挛、强直、强制性阵挛、昏厥、角弓反张 | CNS、神经肌肉、自主性、呼吸 |
反射 | 角膜、翻正、牵张、对光、惊跳反射 | CNS、感觉、自主性、神经肌肉 |
眼症状 | 流泪、瞳孔缩小/散大、眼球突出、上脸下垂、混浊、虹膜炎、结膜炎、血泪症、瞬膜松弛。 | 自主性、刺激性 |
心血管症状 | 心动过缓、心动过速、心率不齐、血管舒张、血管收缩 | CNS、自主性、心脏、肺 |
流涎 | 过多 | 自主性 |
立毛 | 被毛粗糙 | 自主性 |
痛觉丧失 | 反应降低 | CNS、感觉 |
肌肉状态 | 张力减退、张力亢进 | 自主性 |
胃肠 | 软便、腹泻、呕吐、多尿、鼻液溢 | CNS、自主性、感觉、胃肠运动性、肾 |
皮肤 | 水肿、红斑 | 组织损害、刺激性 |
4.5 病理学
4.5.1 临床病理学检查
4.5.1.1 试验接触周期内和/或接触终结时进行血液学方面的检查，包括：凝血（PT、APTT）、血红蛋白浓度、血细胞比容、血小板计数、红细胞计数、白细胞计数和白细胞分类计数等；
4.5.1.2 试验接触周期内和/或接触终结时进行临床血液生化方面的检查，包括电解质平衡、碳水化合物代谢和肝肾功能。某些供试品由于其特定的作用模式可能还需测定：白蛋白、ALP、ALT、AST、钙、氯化物、胆固醇、肌酸酐、CGT、葡萄糖、无机磷、钾、钠、总胆红素、总蛋白、甘油三酯、尿氮、各种酶类等，评价免疫毒性时可考虑测定总免疫球蛋白水平。
尿液检验不作为常规检验，仅在预期或观察到有这方面的毒性反应的情况下才考虑进行，检验时在实验接触的最后一周定时采集尿液，推荐进行一下项目检验：外观、胆红素、尿糖、酮体、隐血、蛋白、沉渣、比重或渗重、尿量。
4.5.2 大体病理学检查
4.5.2.1 试验接触终结时，将全部试验动物无痛处死后进行大体尸检，包括体表及体表开孔、头部、胸（腹）腔及内脏等。
4.5.2.2 将试验动物的肾上腺、脑、附睾、心脏、肾、肝、卵巢、脾、睾丸、胸腺和子宫在取出后尽快称量其湿重，防止干燥以及由此造成的重量减轻。
4.5.2.3 根据供试品预期作用途径选择需进一步进行组织病理学检查的器官或组织，以及供试品作用的靶器官、显示有大体损害迹象或尺寸改变的器官和组织和供试品植入部位组织，取下后置于适宜的固定液中（10%甲醛固定液）。
应取的脏器有：肾上腺*, 主动脉，骨髓(股骨、肋骨或胸骨)，脑* (有代表性部分,包括大脑、小脑和脑桥)，盲肠，结肠，十二指肠，附睾* ，食管，眼，胆囊(如有)，心脏* ，回肠，空肠，肾* ，肝* ，肺和支气管(经固定剂膨胀并浸入内保存)，淋巴结(局部淋巴结覆盖接触位置,远端淋巴结覆盖全身作用)，乳腺(雌性)，肌肉(骨骼)，鼻甲骨(用于吸入研究)，神经(坐骨神经或胫骨神经,最好贴近肌肉)，卵巢* ，胰腺，甲状旁腺，脑垂体，前列腺，直肠，唾液腺，精囊，皮肤，脊髓，脾* ，胸骨，胃，睾丸* ，腺* ，甲状腺，气管，膀胱，子宫* (包括子宫颈和输卵管)，阴道。
4.5.2.4 组织病理学检查
很多医疗器械使用的是常用材料,只是在化学添加剂的用量或类型、加工或灭菌方法上有所不同。根据器械的可浸提物/可沥滤物的毒理学风险评估,如果确定需要对其潜在的全身毒性作用进行生物相容性/安全性评价,可考虑进行简化的组织病理学评价。在此模型中,采用分层方法检查限定数量的靶器官/组织。
限定的组织病理学分析宜包括表3列出的所有Ⅰ层器官/组织。如果在Ⅰ层组织或同步进行的临床病理(临床生化和血液学)观察到有异常或可疑结果,进行Ⅱ层分析(检查上述全部列出的器官/组织)。
表3. 限定组织病理学器官清单
器官系统 | 各系统中的脏器/组织(物种若适用) | Ⅰ层组织 |
循环 | 心脏、动脉、静脉、毛细血管、血液 | 心脏 |
消化 | 口、唾液腺、食管、肝脏、胃、胆囊、胰腺、肠(十二指肠、横结肠、升结 肠、降结肠、回肠、空肠、盲肠、乙状结肠)、直肠、肛门 | 肝脏 |
内分泌 | 下丘脑、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、松果体、胰 | 肾上腺 |
排泄 | 肾脏、输尿管、膀胱、尿道、皮肤、肺、直肠 | 肾脏 |
体被 | 皮肤、皮下组织、头发、指甲 | 皮肤 |
淋巴 | 淋巴结、扁桃体、腺样体、胸腺、脾 | 脾脏 |
神经 | 脑、脊髓、神经、末梢神经、眼、耳 | 脑 |
生殖 | 卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺、阴茎 | 卵巢、睾丸 |
呼吸 | 鼻、鼻腔、咽、喉气管、支气管、肺 | 肺、支气管 |
骨骼 | 股骨、肱骨、桡骨、尺骨、颅骨、胸骨、锁骨、腓骨、胫骨、脊柱、肩胛骨、骨盆、尾椎骨、趾骨、骨髓、软骨、韧带 | 股骨或胸骨 |
造血 | 骨髓 | 股骨、肋骨或胸骨 |
其他 | 大体损伤包括受试部位 | 观察到的器官或组织 |
5、结果评价
5.1 列表给出各种试验数据，包括试验开始时每一试验组动物数量、出现损害迹象的动物数量、损害类型以及每种损害类型动物的百分率。宜统计学方法对数据进行分析评价，但首先要考虑生物学相关性。
5.2 对重复接触试验中的发现应结合以前的研究发现、毒性作用方面的考虑及尸检与组织病理学方面的发现进行评价。
5.3 分析评价试验接触剂量与毒性反应产生的相关性、异常反应的发生率和严重程度，包括行为和临床性异常、大体损害、显微镜下改变、靶器官的鉴别、死亡率、以及任何其他有意义的一般性和特异性反应。