1、前言

细胞毒性评估材料浸提液中潜在的生物活性物质对培养的哺乳动物细胞（）毒性反应。

其原理为黄色水溶液MTT在活细胞内代谢性还原，生成不可溶的甲臜。活细胞的数目与甲臜溶于醇类后用光度计测定的色度相关。

2、试验依据标准

2.1 GB/T 16886.5 -2022 医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验；

2.2 ISO 10993-5:2009 Biological evalsuation of medical devices—Part 6: Tests for in vitro cytotoxicity。

3、试验系统

L929细胞。

4、试验样品制备

依据GB/T 16886.12制备浸提液。

5、试验步骤

5.1 细胞培养准备

采用酶促消化（胰蛋白酶/EDTA）将培养细胞从培养瓶中移出，细胞悬液在200g离心3min。用培养基重悬细胞悬液，调整密度为1×105个细胞/Ml，采用多通道移液器将100μL培养基加到96孔组织培养微量滴定板的外围孔中（=1×104个细胞/孔）。

细胞孵育24h以形成半汇合单层。培养物在含5±1%的CO2培养箱中(37℃±1℃，湿度>90%)培养（24±2）h，使细胞生长形成单层近融合的细胞层。

5.2 接触培养

培养24h后，从板孔中吸出培养液，另加入100μL的测试样品浸提液、对照样品浸提液、空白对照液和阳性对照液，所有剂量需要做至少六个平行。将空白加到96孔板的左（第2列）、右（第11列）两侧。然后在(37±1)℃，含有5±1%的CO2，湿度>90%的环境下培养24h±2h。

5.3 观察

继续培养24h后，在相差显微镜下检查每个板，判定细胞接种系统误差和对照与试验组细胞的生长特性。记录试验样品浸提液细胞毒性作用导致的细胞形态学方面的改变，但这些记录不用与任何细胞毒性定量测定。对照细胞的不良生长特性可表明实验误差，并且可能会因此放弃该试验。

5.4 添加MTT

检查平板板孔细胞生长情况后，小心地从板孔中吸除培养介质，在每个测试板孔中加入50μL的MTT溶液（用不含酚红的完全MEM培养液配置成1mg/mL），在(37±1)℃条件下培养(2±0.2)h。弃去MTT溶液，每孔加入100μL异丙醇溶解甲臜，震荡平板，然后在570nm波长下测量每孔的吸光度值（参照波长650nm）。

5.4 数据分析

活细胞数减少导致了样品中代谢活性降低，这直接与生成的蓝紫色甲臜量有关。测试样品与空白对照（细胞直接与浸提介质接触）比较细胞存活率的降低可用以下公式计算：

式中：OD570e---测试样品、阳性对照、阴性对照各组测得平均吸光度值。

OD570b---空白对照组（细胞直接与浸提介质接触）平均吸光度值。

存活率较低时，试验样品潜在的细胞毒性较高。如存活率下降＜空白的70%，则鱼油潜在的细胞毒性。试验样品50%浸提液的存活率相同或较高，否则宜重复试验。